乙型肝炎病*（HBV）在受感染的肝细胞核中形成共价闭合环状DNA（cccDNA），而当前的抗HBV疗法对cccDNA影响很小，并且不能完全消除HBV。年美国肝病研究学会（AASLD）年会上，日本大阪大学医学系研究科KazuhiroMurai等人报告的一种新抗HBV疗法——CRISPR/Cas9靶向HBV基因组疗法，显示出强效抑制HBV作用，可进一步降低cccDNA水平（摘要编号：82）。《国际肝病》特邀北京大学基础医学院病原生物学系鲁凤民教授团队对该项研究进行点评。
该研究设计了靶向HBV基因组的gRNA（HBV-gRNA）和不靶向HBV或人基因组的对照gRNA，使用慢病*载体将串联Cas9和gRNA的表达框架侵染到整合了HBV基因组的HepG2.2.15细胞和感染HBV19天的人原代肝细胞中，通过荧光定量PCR定量检测培养上清中的HBVDNA水平、胞内前基因组RNA（pgRNA）和cccDNA水平，通过ELISA法定量检测上清HBsAg水平；或使用慢病*载体将gRNA侵染到可诱导Cas9表达的HBV易感细胞HepG2-NTCP-iCas9中，在HBV感染后2天诱导Cas9表达，继续培养数天后，检测上清HBVDNA和HBsAg水平以及胞内pgRNA和cccDNA水平。最后，作者对HBV-gRNA单独作用或联合宿主DNA修复通路抑制后的抗病*效果进行了评价。
结果，表达HBV-gRNA与Cas9的慢病*侵染使得HepG2.2.15细胞整合的HBV基因组发生了插入或缺失突变。与对照gRNA/Cas9相比，HBV-gRNA/Cas9可显著降低HepG2.2.15细胞上清HBVDNA、HBsAg水平和胞内pgRNA水平。同样，在感染了HBV的PHH模型中，HBV-gRNA/Cas9发挥了同样的作用，同时也可降低PHH胞内cccDNA水平。HBV-gRNA侵染后，dox诱导的Cas9表达也降低了上清HBVDNA和HBsAg水平，同时HepG2-hNTCP-iCas9细胞内pgRNA和cccDNA水平也显著下降。另外该研究还显示，siRNA介导的BRCA1敲低对CRISPR抗HBV效果没有产生影响，siRNA介导的PARP1蛋白敲低或PARP1抑制剂olaparib（奥拉帕尼）能显著促进CRISPR治疗时胞内pgRNA的减少。
这项体外研究表明，CRISPR/Cas9靶向HBV基因组疗法可有效抗HBV，且该抗病*效果可能通过调节宿主DNA修复通路得到加强。
点评
我们知道，血清中的HBVDNA大多是不完全双链的松弛环状rcDNA分子，HBV感染人肝细胞后，rcDNA将在病*蛋白和宿主细胞因子的帮助下修复形成cccDNA。cccDNA以微染色体的形式存在于被感染的肝细胞核内并形成稳定的cccDNA池，这些cccDNA是合成HBV转录本的模板，指导HBV转录、翻译，使新产生的病*蛋白装配成完整的HBV病*颗粒释放，感染健康的肝细胞，而这正是导致慢性HBV感染难以治愈的根本原因。
近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术给整个医学和生命科学研究带来了革命性的变化，EmmanuelleCharpentier和JenniferADoudna两位学者也因此获得了今年的诺贝尔化学奖。世界各地的研究人员也纷纷尝试将该技术应用到抗病*领域。目前临床上应用的抗HBV治疗主要通过竞争性抑制逆转录和免疫调节的方式抑制HBV复制，不直接靶向cccDNA，也并不能完全清除HBV，CRISPR/Cas9技术的应用恰好弥补了现有疗法的不足。
CRISPR/Cas9系统靶向结合特异性DNA序列，诱导靶DNA双链发生精确切割，然而在哺乳动物细胞中，这样的切割能够被非同源末端连接（NHEJ）紧急修复系统快速修复。最早的研究利用了这种高效修复方式的不准确性，在修复连接位点附近带入插入或缺失突变，使靶基因丧失表达有功能蛋白的能力。为了解决这种CRISPR/Cas9编辑系统介导的切割后的自我修复问题，我们实验室通过把靶向cccDNA不同区域的双HBV-gRNA串联，通过双点切割移除部分HBV基因组DNA片段。
考虑到机体对DNA的损伤断裂有极强的自我修复作用，这项研究对CRISPR/Cas9靶向HBV基因组抗病*治疗的疗效以及宿主DNA修复通路对其的影响进行了评价。和多位其他研究者报道的结果一致，这项研究的结果说明，靶向HBV基因组的CRISPR/Cas9的确可强效抑制HBV复制和抗原表达，并可有效降低cccDNA水平。早期研究发现，PARP1是烷化剂诱导姐妹染色单体交换的负调节因子，其可在DNA链发生断裂时起保护作用，是一种抗重组因子。因此，该研究独辟蹊径，采取了不同于我们的双点敲除的新策略，即在使用CRISPR/Cas9靶向切割HBV基因组的同时，联合敲减PARP1或使用PARP1抑制剂以有效提高切割效率。结果的确如该文作者所愿，这一措施进一步提高了靶向HBV基因组的CRISPR/Cas9系统的抗病*效能。
除此之外，尽管已有多项研究报道CRISPR/Cas9可在体外发挥显著的抗病*作用，其潜在的脱靶效应以及人体可能对Cas9蛋白产生的免疫反应仍是限制其应用到临床的关键因素。我们近期曾尝试通过细胞源的携带gRNA和功能性Cas9蛋白的外泌体以实现基因编辑功能在不同细胞间传递。未来若能进一步提高递送效率、增强靶向性，相信在不远的将来，CRISPR/Cas9基因编辑系统也会在抗乙肝病*治疗领域发挥应有作用。
专家简介
鲁凤民
北京大学病原生物学系及感染病中心教授、学系主任
北京大学肝病研究所教授
本科毕业于河南医科大学临床医学专业，于哈尔滨医科大学获医学遗传学硕士和博士学位，北京大学公共卫生学院博士后。曾在瑞典、美国留学。年回北京大学医学部病原生物学系工作。
研究方向：乙型肝炎病*及相关肝病、肝癌发病机制及诊断，等。
承担课题：国家自然科学基金委、“传染病重大专项”、北京市科委项目，等课题。
主要学术成就：提出HBV整合致癌新机制；实验证实HBVRNA病*样颗粒的存在，补充完善了HBV的生命周期；提出了以血清HBVRNA检测预测核苷类药物停药风险潜在实验室指标的建议；明确了血清GP73作为不同病因肝硬化的无创诊断指标，等。
在NewEnglandJournalofMedicine、JournalofHepatology、CancerResearch等杂志发表余篇SCI论文(著)，他引超过次。
曾作为参加人两次获得国家科技进步二等奖。
（来源：《国际肝病》编辑部）
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